Инструкция к препарату Биофарма-амплисенс пцр-hcv-fep

Биофарма-амплисенс пцр-hcv-fep(Biofarma-amplisens pcr-hcv-fep) інструкція з використання, дозування

• Биофарма-амплисенс пцр-hcv-fep(Biofarma-amplisens pcr-hcv-fep) інструкція з використання, дозування
• Загальна характеристика
• Склад
• Форма випуску
• Пакування
• Виробник
• Адреса

Биофарма-амплисенс пцр-hcv-fep(Biofarma-amplisens pcr-hcv-fep) інструкція з використання, дозування

загальна характеристика

тест-система «біофарма-амплісенс-плр-hcv-fep» призначена для виявлення рнк вірусу гепатиту с в плазмі периферичної крові методом зворотної транскрипції (зт) і полімеразної ланцюгової реакції (плр) з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією після закінчення реакції. тест-система дає змогу виявляти рнк вгс з чутливістю 250 мо/мл. принцип тестування: виділення тотальної рнк з плазми крові разом з внутрішнім контрольним зразком; проведення реакції зворотної транскрипції рнк; проведення реакції ампліфікації з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією продуктів плр.

тест-система розрахована на 48 тестів, включаючи контрольні зразки.

склад

тест-система складається з двох комплектів реагентів:

«рібо-сорб-12»

комплект реагентів для виділення рнк з плазми крові.

«зт-плр-hcv-fep»

комплект реагентів для проведення реакції зворотної транскрипції і реакції ампліфікації (з гібридизаційно-флуоресцентною детекцією після закінчення реакції).

форма випуску

«рібо-сорб-12» для виділення рнк:

до комплекту додаються наступні контрольні зразки:

комплект розрахований на виділення рнк із 48 проб, включаючи контрольні зразки.

комплект зберігати при температурі від 2 до 8^oс.

«зт-плр-hcv-fep» для реакції зворотної транскрипції і реакції ампліфікації:

до комплекту додаються:

комплект розрахований на 64 реакції, включаючи контролі і калібратори.

комплект зберігати при температурі від 2 до 8^осdtt, от-пцр-суміш-1-fep, от-пцр-суміш-2-fep/frt, tm-ревертазу і полімеразу зберігати і транспортувати при температурі мінус 18±2 ^ос.

матеріали й устаткування.

для виділення рнк з клінічного матеріалу – зона 1:

• твердотільний термостат для пробірок типу «епендорф» на 25–100^ос;
• мікроцентрифуга для пробірок типу «епендорф» до 12 тис.g;
• вортекс-«мініген» або «мікроспін»;
• окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму;
• окремий халат і одноразові гумові рукавички;
• одноразові поліпропіленові пробірки, що загвинчуються або щільно закриваються об'ємом 1,5 мл;
• одноразові наконечники для піпеток перемінного об'єму з аерозольним бар'єром;
• холодильник на 2–8^ос;
• вакуумний відсмоктувач з колбою-пасткою;
• ємність з дезинфікуючим розчином.

для проведення реакцій зворотної транскрипції й ампліфікації, а також детекції продуктів ампліфікації – зона 2:

• ампліфікатор (наприклад, «терцік», «днк-технологія»);
• флуоресцентний плр-детектор (наприклад, «джин», «днк-технологія»);
• плр-бокс або окремий стіл, освітлюваний уф-лампою;
• окремий набір автоматичних піпеток перемінного об'єму;
• одноразові поліпропіленові мікропробірки об'ємом 0,2 мл;
• одноразові наконечники для мікропіпеток з аерозольним бар'єром;
• холодильник на 2–8^ос і на мінус 20^ос;
• окремий халат і одноразові рукавички;
• ємність для скидання наконечників;
• комплект засобів для обробки робочого місця.

підготовка до аналізу.

збирання і збереження зразків.

матеріалом для дослідження є плазма крові.

одержання плазми крові.

забір крові виконується натще з ліктьової вени одноразовою голкою (діаметр 0,8 – 1,1 мм) в одноразову пластикову пробірку з антикоагулянтом (3% розчин едта у співвідношенні 1:20) або спеціальну вакуумну систему типу «venoject» (з едта), «vacuett^®». гепарин як антикоагулянт використовувати не можна! пробірка закривається кришкою і перевертається кілька разів (для перемішування з антикоагулянтом). плазму крові одержують центрифугуванням цільної крові (800 – 1600 g протягом 20 хв). потім відбирають плазму окремими наконечниками з аерозольним бар'єром у стерильні пробірки типу «епендорф» на 1,5 мл. для виділення рнк використовується 100 мкл зразка плазми.

зберігати плазму крові можна не більше трьох діб при температурі від 2 до 8°с, протягом 1 року – при температурі мінус 70 °с.

допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу. при заморожуванні клінічного матеріалу його транспортування повинне проводитися в замороженому стані.

необхідно суворе дотримання правил облаштування, техніки безпеки, виробничої санітарії, протиепідемічного режиму й особистої гігієни при роботі в лабораторіях (відділеннях, відділах) санітарно-епідеміологічних установ.

працюють тільки в одноразових рукавичках, використовують і змінюють при кожній операції одноразові наконечники для автоматичних піпеток з аерозольним бар'єром. одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники) повинний скидатися в спеціальний контейнер, що містить дезинфікуючий 0,2%-ний розчин дп-2т, 5%-ний розчин хлораміну б або в спеціальну ємність з 1nрозчином соляної кислоти.

аналіз проводиться в два етапи в двох окремих приміщеннях (зонах).

усе лабораторне устаткування, у тому числі піпетки, штативи, лабораторний посуд, а також усі робочі розчини повинні бути строго стаціонарними. забороняється їх перенос з одного приміщення в інше. переміщення персоналу з кімнати для детекції продуктів плр в інші приміщення заборонено.

поверхні столів, а також приміщення, у яких проводиться постановка плр, повинні обов'язково до початку і після початку робіт опромінюватися ультрафіолетовим світлом.

проведення аналізу.

етап 1. виділення рнк з плазми крові

проводиться в зоні-1 -кімнаті для обробки клінічного матеріалу.

порядок роботи.

1. лізуючий розчин і розчин для відмивання прогріти при 60^ос до повного розчинення кристалів. для виділення рнк з 12 проб, включаючи контролі, у баночку з лізуючим розчином додати стерильним наконечником з бар'єром 130 мкл внутрішнього контрольного зразку (вкз). вмісти ретельно перемішати. суміш лізуючого розчину з вкз зберігається не більш 30 хв.

2. у пробірки на 1,5 мл розкапати по 450 мкл приготовленої суміші лізуючого розчину з вкз

3. у кожну пробірку додати по 100 мкл досліджуваної плазми, закрити кришку і перемішати на вортексі. осадити на центрифузі для скидання крапель рідини з кришки.

4. для кожної панелі необхідно поставити негативний контрольний зразок (нкз) і позитивний контрольний зразок (пкз-1 вгс). для негативного контролю в пробірку з лізуючим розчином додати 100 мкл негативного контрольного зразку (нкз). для позитивного контролю в пробірку додати по 90 мкл нкз і по 10 мкл позитивного контрольного зразку (пкз), перемішати на вортексі й осадити краплі рідини з кришки.

5. ресуспендувати сорбент, інтенсивно перемішуючи на вортексі. додати в кожну пробірку окремим наконечником по 25 мкл ресуспендованого сорбенту.

6. перемішати вміст пробірок на вортексі і залишити на 10 хв при кімнатній температурі, ретельно перемішуючи кожні 2 хвилини.

7. центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хвилини.

8. відібрати надосадову рідину з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

9. додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 1. перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хв. відібрати надосадову рідину з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

10. додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 3. перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хв. відібрати етанол з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

11. повторити відмивання розчином для відмивання 3.

12. додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 4. перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту. центрифугувати пробірки на мікроцентрифузі при 10.000 g протягом 1 хв. цілком відібрати ацетон з кожної пробірки окремим наконечником, використовуючи вакуумний відсмоктувач.

13. висушити сорбент, помістивши пробірки з відкритими кришками в термостат на 56^ос на 10 хв.

14. ресуспендувати сорбент у 50 мкл рнк-елюента. прогріти в термостаті при температурі 56^ос 5 хв, перемішати на вортексі й осадити сорбент на центрифузі при 10.000 g протягом 2 хв.

увага! отриманий препарат рнк збереженню не підлягає, зт-плр повинна бути проведена протягом 20 – 30 хвилин після виділення рнк!

етап 2. проведення реакції зворотної транскрипції (зт) і ампліфікації

(загальний об'єм реакції – 50 мкл, об'єм рнк-проби – 25 мкл)

увага! при роботі з рнк необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові видаткові матеріали, що мають спеціальне маркірування «rnase-free», «dnase-free».

1. відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,5 мл.

2. приготувати реакційну суміш. для цього в пробірку з ліофілізованим dtt послідовно додати 300 мкл зт-плр-суміши-1-fep, 200 мкл зт-плр-суміши-2-fep/frt, 20 мкл полімерази і 10 мкл тм-ревертази, ретельно перемішати на вортексі й осадити краплі з кришки пробірки.

3. внести в мікропробірки по 25 мкл готової реакційної суміші. невикористані залишки реакційної суміші викинути.

4. зверху розкапати по 1 краплі мінеральної олії для плр (приблизно 25 мкл).

5. узяти підготовлені для зт-плр пробірки. під олію або безпосередньо на поверхню олії внести по 25 мкл рнк-проб, використовуючи наконечник з аерозольним бар'єром (при додаванні рнк-проб необхідно уникати попадання сорбенту в реакційну суміш для зт-плр).

6. для кожної панелі необхідно поставити 4 контролі плр:

контроль ампліфікації пкз – у пробірку внести 25 мкл днк-калібратора пкз hcv кз,

контроль ампліфікації вкз – у пробірку внести 25 мкл днк-калібратора вкз hcv вз

два негативних контроля – у пробірку внести 25 мкл рнк-елюента. одна з пробірок з негативним контролем при аналізі результатів буде використана як фонова пробірка.

7. помістити пробірки в ампліфікатор і запустити програму «50-95-60».

програма «50-95-60» для ампліфікатора «терцик»:

50^ос – 30 хв

95 ^ос – 15 хв

42 цикла: 95 ^ос – 20 сек/ 60 ^ос – 20 сек/72 ^ос – 20 сек

8. після закінченні виконання програми ампліфікації розпочати детекцію результатів.

етап 3 а. детекція за допомогою флуоресцентного плр-детектора «джин»

(шляхом виміру флуоресцентного сигналу після закінчення ампліфікації).

детекція за допомогою флуоресцентного плр-детектора «джин» проводиться відповідно до опису в «паспорті детектора плр флуоресцентний джин».

для детекції і обліку результатів використовуються стандартні настроювання* тесту «hcv» програми «gene», задані за замовчуванням (граничні значення для «-» 1,75; для «+» 2,1; для «вк» 2,5).

* настроювання тесту можна переглянути, вибравши меню «настроювання», «список тестів» у головному меню програми і, якщо значення змінені, потрібно відновити початкові значення, зазначені вище.

1. включити прилад і запустити програму «gene» на комп'ютері, приєднаному до приладу.

2. задати протокол виміру. ввести кількість вимірюваних зразків і кількість фонових пробірок (1), вибрати потрібну інфекцію (hcv) у списку тестів у графі «тест», натиснути кнопку «ok» (кнопкою миші) і ввести послідовність детектуємих зразків (у колонку «зразок»).

3. як зразок, позначеного «фон» використовувати пробірку з негативним контролем.

4. поставити пробірки в осередки модуля приладу «джин» відповідно до заданої послідовності (спочатку перші 12 зразків) і запустити детекцію, натиснувши кнопку, позначену значком кольорової призми, у панелі активних кнопок (вгорі екрана). після закінчення детекції першої групи замінити пробірки на наступну групу пробірок і продовжити вимірювання, натиснувши кнопку «ok». після закінчення детекції вийняти пробірки і натиснути кнопку «ok».

облік результатів.

1. отримані дані інтерпретуються автоматично за допомогою програми «gene» (стовпчик «результат» на екрані). позитивні зразки позначаються знаком «+» на червоному тлі; негативні зразки – знаком «-» на зеленому тлі; зразки, для яких отриманий сигнал, якому не можна однозначно інтерпретувати, що вимагають повторного аналізу, позначені знаком «?» на жовтому тлі; і зразки, у яких не детектується (не перевищує тла) як специфічний сигнал, так і сигнал вкз, що потребує повторного аналізу, позначені знаком «нд» на жовтому тлі.

приклад таблиці обліку отриманих результатів представлений нижче:

2. результат вважається достовірним тільки у випадку проходження позитивних і негативних контролів ампліфікації і негативного контролю виділення днк.

таблиця. оцінка результатів аналізу контрольних крапок

3. відсутність позитивного сигналу на каналі.

4. зразки, у яких відсутній специфічний сигнал, як по каналі «специфіка» так і по каналі «вк», позначаються в графі результатів знаком «нд» (не детектується) на жовтому тлі. ці зразки вимагають повторного проведення плр і детекції. у випадку якщо повторно отриманий результат «нд», потрібно повторити аналіз зразка, починаючи з етапу виділення. (для зразка «k-» результат «нд» є нормою).

5. відсутність позитивного сигналу в пробі з позитивним контролем плр може свідчити про неправильно обрану програму ампліфікації і про інші помилки, допущені на етапі постановки плр. у такому випадку необхідно провести плр ще раз.

6. якщо в негативному контролі (нк або к-) детектується позитивний сигнал, виходить, відбулася контамінація реактивів або проб. у цьому випадку результати аналізу по всіх пробах вважаються недійсними. потрібно повторити аналіз проб, а також вжити заходів по виявленню джерела контамінації.

чутливість виміру рнк вгс тест-системи «біофарма-амплісенс-плр- hcv-fep (gene)» складає 250 мо/мл.

етап 3b. детекція за допомогою флуоресцентного плр-детектора «ala-1»

(шляхом виміру флуоресцентного сигналу по закінченню ампліфікації).

якщо виробником тест-системи не були задані параметри використовуваного тесту, то перед виміром флуоресцентного сигналу необхідно установити параметри тесту (див. нижче). якщо такий тест існує, то необхідно переконатися у відповідності параметрів.

порядок установки параметрів тесту «hcv-fep».

1. запустити програму «ala-1» на комп'ютері, приєднаному до приладу.

2. у головному меню програми вибрати «настроювання» > «tест».

3. натиснути кнопку новий (у верхньому правому куті).

4. в меню, що відкриється, задати назву тесту «hcv-fep», натиснути кнопку ок.

5. у групі параметрів канали відзначити галочкою всі задіяні в тесті канали (fam, hex).

6. у групі укз відзначити канал, що використовується для внутрішнього контролю (hex).

7. у полях п- і п+ установити порогове значення для відношення сигнал/фон по каналі для детекції специфічної днк:

fam: «п-» = 1.80, «п+» = 2.10;

в полі вкз/фон задати порогове значення відносини сигналу по каналі для детекції вкз до фону:

«вкз/фон» = 2.5.

8. у групі параметрів рівень фону установити значення флуоресценції, припустимі для фонових пробірок:

fam: = 100.00;

hex: = 100.00

rox = 0.00;

9. ввести назви мішеней у блок параметрів прив'язка каналів і співвіднести їх з каналами детекції. для цього надрукувати назву мішені у вільне поле і натиснути клавішу додати, при цьому нова мішень з'явиться в стовпці вже існуючих у пам'яті приладу мішеней назва мішені в стовпці прив'язка каналів виділити курсором і натиснути відповідну їй кнопку каналу для детекції.

hcv = fam

10. у поле довірчий інтервал установити значення 200%.

11. натиснути кнопку зберегти.

проведення виміру флуоресцентного сигналу.

1. включити прилад і запустити програму «ala-1» на комп'ютері, приєднаному до приладу.

2. задати протокол виміру. для цього в головному меню вибрати «протокол» > «створити новий» або «відкрити», щоб відкрити створений раніше протокол.

3. у вікні протоколу необхідно вибрати тип використовуваного ротора (36х0,5 або 48х0,2), відзначити номер протоколу, вибрати в меню-вкладці назву тесту «hcv-fep».

4. у колонку зразок послідовно заповнити список детектируємих зразків у порядку постановки в ротор (проти часової стрілки).

5. позначити зразки, що є фоновими для даної групи зразків, як «фон» (використовуючи сполучення клавіш «ctrl» і «f»). як зразки, позначених «фон» використовувати пробірки з контрольними зразками «фон».

6. перевірити, щоб у колонку тест напроти кожного зразка був зазначений відповідний тест («hcv-fep»).

7. закрити вікно редагування протоколу, натиснувши на кнопку exit у верхньому лівому куті панелі. протокол зберегти.

8. установити пробірки в осередки ротора відповідно до заданої послідовності і запустити детекцію, вибравши в меню «протокол» > «детекція» або значок детекція по протоколу в панелі інструментів (вгорі екрана).

облік результатів.

1. отримані дані інтерпретуються автоматично за допомогою програми «ala-1». результати в таблиці представляються за допомогою наступних позначень: «виявлений» – позитивний результат;

«не виявлено» – негативний результат;

«сумнівно» – результат, який не можна однозначно інтерпретувати (сигнал по каналі, відведеному для детекції специфічної днк, перевищує порогове значення, припустиме для негативних зразків, але не перевищує порогове значення для позитивних зразків (сигнал у так названій «сірій зоні»);

«нд» – недостовірний результат (у зразку не детектується (не перевищує заданого порогового значення) ні специфічний сигнал, ні сигнал укз).

2. результат вважається достовірним тільки у випадку проходження позитивних і негативних контролів ампліфікації і негативного контролю виділення днк (див. таблицю).

таблиця . результати автоматичної інтерпретації аналізу контрольних точок «hcv-fep».

3. зразки, для яких отриманий результат «сумнівний», вимагають повторного проведення плр і детекції.

4. зразки, для яких отриманий результат «нд» (крім к-), вимагають повторного проведення плр і детекції. у випадку якщо повторно отриманий результат «нд», потрібно повторити аналіз зразка, починаючи з етапу виділення. для зразка «k-» результат «нд» є нормою.

5. відсутність позитивного сигналу в пробі з позитивним контролем плр може свідчити про неправильно обрану програму ампліфікації і про інші помилки, допущених на етапі постановки плр. у такому випадку необхідно провести плр ще раз.

6. якщо в негативному контролі (нк або к-) детектуєтся позитивний сигнал, виходить, відбулася контамінація реактивів або проб. у цьому випадку результати аналізу по всіх пробах вважаються недійсними. потрібно повторити аналіз проб, а також ужити заходів по виявленню джерела контамінації.

7. якщо вимірювана частина пробірок забруднена флуоресціюючими агентами, значення флуоресценції в пробірках фон будуть перевищувати 200 одиниць. у цьому випадку необхідно протерти нижню частину пробірок 30-70% етанолом, висушити і повторити вимір.

знезаражування біоматеріалу і реагентів варто проводити на кожній стадії окремо, вміщуючи одноразовий пластиковий посуд (пробірки, наконечники), колби-пастки вакуумних відсмоктувачів на 20 – 24 години в спеціальні контейнери, що містять дезинфікуючий 0,2% розчин дп-2т, 10%-ний розчин хлорного вапна, 5%-ний розчин хлораміну б.

умови і термін зберігання. комплекти «рібо-сорб-12» , «зт-плр-hcv-fep» (крім dtt, зт-плр-суміш-1-fep, зт-плр-суміш-2-frt, ревертази і полімерази) зберігаються при температурі від 2 до 8 ⁰с. dtt, зт-плр-суміш-1-fep, зт-плр-суміш-2-frt, ревертазу і полімеразу з комплекту №2 зберігати і транспортувати при температурі мінус 18±2 ^ос.

термін придатності - 6 місяців.

пакування

«рібо-сорб-12»

комплект реагентів для виділення рнк з клінічного матеріалу.

реактив:

лізуючий розчин – 4 флакони по 5,8 мл;

розчин для відмивання 1 – 4 флакони по 8,0 мл;

розчин для відмивання 3 – 4 флакони по 15 мл;

розчин для відмивання 4 – 4 флакони по 8,0 мл;

сорбент – 4 пробірки по 0,4 мл;

рнк-елюент (depc-h₂o) – 4 пробірки по 1,0 мл;

нкз (негативний контрольний зразок) – 1 пробірка по 0,5 мл;

пкз-1 hcv (позитивний контрольний зразок 1) – 4 пробірки по 0,01 мл;

вкз hcv-frt (внутрішній контрольний зразок) – 4 пробірки по 0,13 мл;

комплект розрахований на виділення рнк із 48 проб, включаючи контрольні зразки.

«зт-плр-hcv-fep”»

комплект реагентів для проведення зворотної транскрипції й ампліфікації.

реактив:

до комплекту додаються:

комплект розрахований на 64 реакції, включаючи контролі і калібратори.

виробник

зат «трудовий колектив київського підприємства з виробництва бактерійних препаратів "біофарма".

адреса

україна, 03038, м. київ, вул. м. амосова, 9.